Методы идентификации белков вестерн блот. Основы вестерн-блоттинга. Применение в практической медицине

Вестерн блоттинг

Профессор кафедры биохимии
и молекулярной биологии,
Д.м.н. Спирина Людмила
Викторовна
Вестерн блоттинг

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,

аналитический
метод,
используемый для
определения
специфичных
белков в образце.

Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)

Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,
белковый иммуноблот, Western bloting)
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории
Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)
Название вестерн-блот было дано технике У.
Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от
названия Саузерн Блоттинг (Southern blotting). методики определения ДНК, разработанной
ранее Эдвином Саузерном

Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)

Western Blotting –
метод определения
белков
Саузерн блоттингметодики
определения ДНК,
разработанной
ранее Эдвином
Саузерном Southern
blotting).
Аналогичный метод
определения РНК
называется Нозерн
Блоттинг (Nothern
blotting).
Детекция
посттрансляционных
модификаций белков
называется Истерн
Блоттингом (Eastern
blotting).

протокол. ПРОТОКОЛ

ПРОТОКОЛ
1. Разделение белков
методом SDS-PAGE гельэлектрофореза/
С помощью гель-электрофореза
белки разделяются в
полиакриламидном геле.
2. Перенос белков на
мембрану
3. Блокирование и Детекция
Затем их детектируют с
использованием антител:
сначала белки связываются с
первичными (моно- или
поликлональными) антителами,
которые в свою очередь
связываются
со вторичными антителами,
конъюгированными с ферментами
(пероксидазой хрена или
щелочной фосфатазой).

протокол. Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг.

протокол.
Вестерн-блоттингом можно обнаруживать
антиген в количествах менее 1нг.
4. Визуализация.
Высокая степень
разрешения достигается за
счет электрофоретического
разделения белков и
специфичности
моноклональных антител.
Визуализация
исследуемого белка
достигается путем
проведения
соответствующей
биохимической реакции с
образованием продукта,
который определяется
колориметрическим,хемилюминесцентным,
флюоресцентным методами
детекции.

5. Анализ.

Количество белка оценивается с
помощью денситометрии.

Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть геном

Геномную ДНК (обычно
выделенную из
лейкоцитов или клеток
плода) расщепляют на
короткие фрагменты,
разделяют их в агарозном
геле, переносят на
мембрану, после чего
идентифицируют
специфические участки с
помощью гибридизации с
олигонуклеотидными
зондами.

Nothern Blotting

Аналог Southern Blotting.
Этот метод позволяет выявить специфическую
мРНК и оценить ее размер.

Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)

Определение метода Вестерн Блоттинг

Метод основан на
комбинации гельэлектрофореза и
иммунохимической
реакции «антигенантитело».

«Твердая фаза» для иммуноблота

пористые материалы типа
нитроцеллюлозы (PVDF) в виде
наполнителей в объеме или в виде
плоских листов или полосок стрипов
(англ. strip); стрипы используют в
методиках типа иммуноблота и
иммунохроматографии;
в пористых материалах существенно
больше площадь, на которой
сорбирован один из участников
взаимодействия; другие реагенты
диффундируют по порам.

Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга

Подготовка образца

Образец может быть взят из цельной
ткани или из клеточной культуры. В Цельная ткань
Клеточная культура
большинстве случаев, твёрдые ткани
сначала измельчаются механически
с использованием блендера (для
образцов большого объёма), с
Механическое измельчение
использованием гомогенизатора
(меньшие объемы), или
обработки ультразвуком.
Различные детергенты детергенты,Измельчение гомогенизатором
соли и буферы могут быть
применены для
улучшения лизиса клеток и
растворения белков.
Обработка ультразвуком
Ингибиторы протеаз и фосфатаз част
о добавляются для предотвращения
расщепления образцов их
Измельчение в жидком азоте
собственными ферментами.
Подготовка тканей часто
выполняется при низких
температурах, чтобы
Ингибиторы протеаз, фосфатаз
избежать денатурации белка.
Условия, улучшающие
пробоподготовку
Детергенты, соли, буферы
производит гомогенизацию образцов за счет их встряхивания
в микропробирках или чашах вместе с твердыми шариками
Низкие температуры

Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез. Наиболее
распространенный способ
разделения белков -
электрофорез в
полиакриламидном геле в
присутствии SDS по Лэмми

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез
SDS вызывает
денатурацию белков
и поддерживает их в
денатурированном
состоянии, для
разрушения
вторичных и
третичных структур
белков используют
восстановители
дисульфидных
связей

Гель -электрофорез

Подлежащие
анализу белки в
присутствии
додецилсульфата
натрия приобретают
одинаковый
отрицательный
заряд, что делает
возможным их
разделение в
зависимости только
от молекулярной

Принцип электрофореза

Предварительно
денатурированные белки
вносят в карманы «треков»
(дорожек) акриламидного геля
с низкой концентрацией
(концентрирующий гель), что
позволяет их сконцентрировать
перед переходом в
разделяющий гель (с более
высокой концентрацией), где
происходит разделение белков
в зависимости от молекулярной
массы.
Белки мигрируют в
электрическом поле через
акриламидный гель к аноду,
при этом белки меньшего
размера двигаются быстрее.

Принцип электрофореза

Отличия в скорости
продвижения -
электрофоретической
подвижности приводит к
разделению белков на полосы.
Как правило, одну из
«дорожек» оставляют для
маркеров молекулярной массы
(смеси белков с известными
массами).

Окрашивание гелей

окрашивание белков в
гелях красителем
Кумасси
окрашивание белков в
гелях серебром
Для визуализации результатов электрофореза чаще
всего используют окрашивание белков в гелях
красителем Кумасси или серебром

В большинстве случаев результаты
электрофоретического разделения достаточно
получить путем визуальной оценки геля.
Однако, с целью получения достоверных данных и
надлежащего документирования результатов гель
сканируют на просвет при помощи высокочувствительного
денситометра, что позволяет надежно определять не
только положение белков в геле, но и оптическую
плотность белкового пятна.
Окрашивание
мембраны более
надежно

Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг

С помощью специального программного приложения
можно определить такие параметры как
электрофоретическая подвижность белка, его
чистота, количество белка в пятне и др.
Чаще используют хемилюминесцентную систему
детекции белков – использование рентгеновских пленок
(Блоттинг)
Используют
программное
приложение ImageJ

Применение системы визуализации для WB (см. ниже)

Анализ электрофоретического разделения белков

Определение молекулярной массы исследуемого белка
предполагает необходимость калибровки геля по
молекулярным массам. Калибруют гель относительно
молекулярных масс белков-маркеров, которые
разделяют параллельно с исследуемым образцом.

Выбор % разрешающего геля.

концентрация
акриламида определяет
разрешающую
способность геля - чем
выше концентрация
акриламида, тем лучше
разделение
низкомолекулярных
белков. Низкая
концентрация
акриламида улучшает
разрешающую
способность гельэлектрофореза для
высокомолекулярных
Размер белка, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изг

Перенос на мембрану
Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской
геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF.
Мембрана накладывается поверх геля,
а поверх неё кладут стопку
фильтровальной бумаги.
Метод переноса белков
называется электроблоттингом и
использует электрический ток, который
переносит белки из геля на мембрану.
Белки перемещаются из геля на
мембрану с сохранением своего
расположения. В результате этого
«промакивания» (blotting) процесса
белки удерживаются на тонком
поверхностном слое мембраны для
детекции.
Оба варианта мембран используют изза их свойства неспецифично связывать
белки.
Связывание белков основано как
на гидрофобных взаимодействиях, так
и на электростатических
взаимодействиях между мембраной и
белком.
Нитроцеллюлозная мембрана дешевле
PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже
выдерживает повторное нанесение
меток.

Виды электроблоттинга

Сухой
Влажный
Полусухой
(semidry)

Окрашивание белков на фильтре

Способ
окраски
Ponceau S
Чувствительность,
количество
белка
1-2µg
Нитроцеллюлоза
+
Нейлон
-
PVDF
+
Amido
Black
1.5µg
+
-
+
Comassie
blue
1.5µg
+
-
+
India ink
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Colloidal
gold
3ng
+
-
+
Окрашивание
обратимое
постоянное, низкий фон
постоянное, высокий фон
постоянное
постоянное, бледнеет со
временем
постоянное

Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)

Блокирование

Как только выбрана
мембрана, выбраны антитела
и целевой белок, должны
быть приняты меры по
исключению взаимодействия
между мембраной и
антителом, используемым для
детекции целевого белка (ибо
антитело само по себе белок).
Блокирование
неспецифичных связываний
достигается помещением
мембраны в разбавленный
раствор белка - обычно это
бычий сывороточный
альбумин или нежирное
сухое молоко или желатин
с небольшим процентом
детергента типа Tween-20.
Блокирование – один из
важных этапов
проведения
эффективного Вестерн
блоттинга

Механизм блокирования

Белок
из разбавленного
раствора прикрепляется к
мембране во всех местах,
где не прикрепился целевой
белок. Поэтому, при
добавлении антител, им
(антителам) нет свободного
места на мембране, куда бы
они могли прикрепиться,
кроме сайтов связывания на
специфичных целевых
белках. Этот фоновый
«шум» в окончательном
продукте вестерн блота
приводит к чистым
результатам и
исключению ложно-

Детекция. Непрямой и прямой WB

преимущества
Вторичное антитело усиливает сигнал (несколько вторичных
антител могут связываться с одним первичным)
Имеется широкий выбор вторичных антител
Одно вторичное антитела может быть использовано для
детекции различных специфичных антител
связывание с ферментативной меткой вторичного антитела не
влияет на иммунореактивность первичного антитела
Замена вторичного антитела может способствовать изменению
метода детекции
недостатки
Вторичные антитела способствуют образованию сайтов
неспецифичного связывания
Дополнительные этапы работы
преимущества
необходимость использовать только
первичные антитела, что ускоряет процесс
возможность использовать первичные
антитела с разными метками
Недостатки
связывание с ферментативной меткой
может снижать иммунореактивность
первичного антитела
высокая стоимость первичных антител
проблема выбора антитела и низкий
сигнал

Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным).

Раствор антител и мембрана
могут быть вместе закрыты и
инкубированы от 30 минут
до оставления на ночь.
Также они могут быть
инкубированы при
различных температурах,
при повышенной
температуре наблюдается
лучшее связывание.
После удаления
несвязавшихся первичных
антител, мембрану
выдерживают со вторичными
антителами и в соответствии
с их целевыми свойствами,
как правило называются по

Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции.

Антитела получают из
животного источника и
связываются с
большинством первичных
антител. Вторичные
антитела обычно связывают
щелочной фосфатазой или
пероксидазой хрена.
Наиболее
распространенные,
связанные с пероксидазой
хрена вторичные антитела
используются для
разрезания
хемилюминесцентного
агента, и продукт реакции
производит люминесцентное
излучение пропорционально
количеству белка.
Лист светочувствительной
фотографической пленки
помещается напротив мембраны
и подвергается действию
излучения реакции, создавая
изображение полос антител на
блоте.
Более дешевый, но менее
чувствительный подход с
использованием 4хлорнафтольного окрашивания
в смеси с 1 % перекисью
водорода, что дает темнокоричневое окрашивание,
которое регистрируется без
использования специальной
фотографической пленки.

Другой метод детекции
вторичными антителами
использует антитела со
связанным флюорофором,
который излучает в
ближней инфракрасной
области (NIR). Свет,
излучаемый
флюоресцентным
красителем, постоянен и
делает флюоресцентную
детекцию более точным и
чувствительным способом
измерения разницы в
сигнале, производимом
белками, которые мечены
антителами, на вестерн
блоте.

Детекция. Другие методы детекции.

Третий альтернативный
метод использует
радиоактивную метку
вместо фермента,
связанного с вторичным
антителом (с
радиоактивным изотопом
йода). Другие методы
безопаснее, быстрее и
дешевле, поэтому
радиоактивная детекция
используется редко.

Визуализация.

Визуализация
осуществляется с
помощью гельдокументирующих
систем или цифровой
камерой.

Представление фильма

Stain free technology

На практике, не во всех
вестернах обнаруживают
белки лишь по одному бэнду
на мембране.
Приблизительный размер
вычисляют сравнивая
окрашенные бэнды с
маркерами молекулярной
массы, добавленными при
электрофорезе.
Процесс повторят с
структурными белками,
такими как актин или
тубулин, которые не
меняют между
экспериментами. Количество
целевого белка зависит от
количества контрольного
структурного белка между
группами. Этот прием
обеспечивает коррекцию
количества общего белка на
мембране в случае ошибки

Анализ и представление результатов.

Использование
программного
приложения Image
J.
Программного
приложение BioRad

ИГХ
Иммунная
флюоресценция
Вестерн
блоттинг

Применение метода

Вестерн-блоттинг
используется
в молекулярной
биологии, биохимии, гене
тике и в других
естественно-научных
дисциплинах.
В медицине:
диагностика ВИЧ
(СПИД), болезнь
лайма,Helicobacter
Pylori, вирус ЭпштейнБарр

Полный протокол

1. электрофорез
2. перенос
3. блокирование
4. инкубация с
первичным антителом
5.отмывка
6.инкубация со
вторичным антителом
7. отмывка
8. обработка
хемилюминесцентной
системой детекции
9. детекция с помощью
рентгеновской пленки
10. анализ

Применение в практической медицине

Подтверждение
инфицированности ВИЧ
Диагностика клещевого
боррелиоза (болезнь Лайма)
Диагностика сибирской язвы
Диагностика токсоплазмоза
(Т);
группу инфекций –
гепатиты, сифилис,
хламидиоз, листериоз и др.
(О);
краснуху (R);
цитомегаловирусную
инфекцию (С);
герпес (Н).
Вирус Эпштейн-Барр
В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены
только
клинически
значимые
антигены
(нативные,
синтетические или рекомбинантные) в определенном
порядке. Такой подход используют для дифференциальной
диагностики нескольких инфекций на одном стрипе

Скачать методичку

Суть метода. Вестерн-блоттинг (иммуноблотинг, от англ. Blotting — промокание) - современный высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител.

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моно- или поликлональных антител. В оптимально подобранных условиях Вестерн-блоттингом можно обнаружить белок в количестве менее 1 нг.

Этапы Вестерн-блоттинга:

1. Разделение белков методом SDS-электрофореза. Наиболее распространенным способом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS ). В присутствии SDS белки подлежащие анализу приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Денатурированные белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Так же на гель наносят маркеры (смесь белков с известными молекулярными массами). Отличия в скорости продвижения (электрофоретической подвижности) приводит к разделению белков на полосы.
2. Перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF ) происходит под действием электрического тока. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны, где за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий происходит их связывание с мембраной. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
3. Блокирование. Для того, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной, последнюю инкубируют в разбавленном растворе белка - обычно используют бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет белковых полос. В результате антитела при их добавлении могут связываться только со специфичными сайтами связывания исследуемых белков. Блокирование позволяет достичь чистого фона и исключить получение ложноположительных результатов.
4. Связывание исследуемого белка с антителами. После блокирования мембраны ее отмывают буфером (3 раза) и последовательно инкубируют с различными антителами методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые, в свою очередь, связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
5. Детекция. Визуализации исследуемого белка достигают путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяют колориметрическим, хемилюминесцентным или флюоресцентным методами детекции. Количество белка оценивают с помощью денситометрии.

Планируется визуализировать и определить количество белка светособирающего комплекса фотосистемы 2 – Lhcb2 из тилакоидов Arabidopsis thaliana .
Все вопросы и предложения присылать по адресу.

Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

Методы разделения молекул для блоттинга:

• электрофорез в полиакриламидном геле:
o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
• изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
• двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
• электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
o по длине линейных фрагментов;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
• тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

Методы переноса:

• диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
• капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
o в камерах с погружением геля в буфер;

• вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
• электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
• "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
• дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

Типы мембран:

• PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
• NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
• нейлоновые мембраны (применяются для НК).

Способы мечения и детекции макромолекул на мембране:

• окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
• иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
• радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
• гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
• масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

Принятые названия разновидностей блоттинга:

• Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
• нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
• вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
• фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
• соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
• истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
• фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.

Описание

Метод определения Иммуноблот (Western blot)

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Развернутое исследование антител класса IgM к антигенам боррелий методом Вестерн-блота. Диагностика ранних стадий Лайм борреллиоза основана преимущественно на характерных клинических признаках (мигрирующая эритема). Но у 20-45% больных возможна безэритемная форма заболевания. Диагностика в таких ситуациях по клиническим признакам практически невозможна. Серологические методы исследования часто помогают поставить правильный диагноз, хотя информативность серологического тестирования боррелиоза, к сожалению, ограничена. Определение антител класса IgM методом ИФА при серологической диагностике боррелиозной инфекции часто дает неясные результаты. У части пациентов отмечают длительное персистирование IgM антител, которые таким образом не всегда отражают свежую инфекцию. На поздней стадии боррелиоза положительный результат исследования IgM не дает никакой дополнительной информации. Распространенность антител к боррелиям в нормальной популяции зависит от региона и у людей, работающих в лесной зоне, может составлять до 40%. Антитела класса IgM иногда могут быть обнаружены спустя годы после возникновения инфекции или после лечения антибиотиками. Причина ложноположительных результатов часто остается невыясненной. В то же время, отрицательный результат по IgM не исключает наличия свежей инфекции, у части пациентов с текущей инфекцией отмечают серонегативность (отрицательный результат при исследовании специфических IgM и/или IgG). Нередки случаи расхождения результатов тестирования антител к Borrelia burgdorferi тест-системами разных производителей, что зависит от специфичности используемых антигенов и чувствительности систем. Таким образом, в диагностике боррелиоза часто возникает потребность в дополнительном серологическом исследовании, которое может дать более подробную информацию при неясной клинической картине или вызывающих сомнение результатах исследования IgM и IgG методом ИФА. Исследование IgM антител к боррелиям методом Вестерн-блота позволяет дать развернутый ответ по наличию антител к 10 различным антигенам боррелий, включая специфичный антиген OspC p25, являющийся маркером свежей инфекции. Обнаружение IgM антител против различных специфичных антигенов боррелий, при отсутствии антител к OspC, не считается достаточным указанием на недавно возникшую инфекцию. Для установления диагноза свежей боррелиозной инфекции полученный положительный результат по IgM-антителам следует подтвердить через 3-6 недель положительным результатом по антителам класса IgG на свежевзятом образце крови. Источник антигенов в данном тесте - белки из экстракта специально подобранного штамма Borrelia afzelii и рекомбинантный антиген VisE. Специфичность антигенов:

VisE	Экспрессированная основная вариабельная белково-подобная последовательность	Специфичен
83 кДа	Белок мембранных везикул р83	Специфичен
39 кДа	BmpA, p 39	Специфичен
31 кДа	OspA, p 31	Специфичен
30 кДа	p 30	Специфичен
25 кДа	OspC, p 25, маркер свежей инфекции	Специфичен
21 кДа	p 21	Специфичен
19 кДа	p 19	Специфичен
17 кДа	p 17	Специфичен

Распространенность положительного результата исследования антител класса IgM к боррелиям методом Вестерн-блота у клинически охарактеризованных пациентов c боррелиозом и здоровых доноров крови:

Литература

1. Долгих Т. И. Современные возможности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний (методы, алгоритмы, интерпретация рзультатов). Омск: 2005. - 40 с.
2. Информационно-методическое письмо «Профилактика и диагностика клещевых боррелиозов» № 17-22/65 17 мая 2005 г. Территориальное управление федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по городу Москве».
3. Clinical relevance of different IgG and IgM antibody responses to Borrelia bugdorferi after antibiotic therapy for erythema migrans. Long-term follow-up study of 113 patients. - Arch.dermatol. 2006, vol. 142, p. 862-868.
4. Nau R.. Christen H-J., Eiffert H. Lyme Disease—Current State of Knowledge. - Dtsch Arztebl Int. 2009; 106(5): 72-82
5. Материалы фирмы- производителя реагентов (Euroimmun).

Подготовка

Формат выдачи результата: качественный (описание наличия/отсутствия полос, характеризующих выявление антител к каждому из указанных антигенов в форме «положительно» или «отрицательно»; общее заключение о результате исследования в форме: «положительный»/«отрицательный»/«неопределенный»).

Референсные значения: отрицательный.

Интерпретация результатов

Положительный. Антитела класса IgM обнаружены. Обнаружение IgM антител против различных специфичных антигенов боррелий, при отсутствии антител к OspC, не считается достаточным указанием на недавно возникшую инфекцию. Для установления диагноза свежей боррелиозной инфекции полученный положительный результат по IgM-антителам следует подтвердить через 3-6 недель положительным результатом по антителам класса IgG на свежевзятом образце крови.

Отрицательный. Антитела класса IgM не обнаружены. Отрицательный результат по IgM не исключает полностью вероятности наличия свежей инфекции. При имеющихся клинических подозрениях на клещевой боррелиоз, целесообразно повторить исследование на специфические IgM и IgG антитела через 3-4 недели.

Неопределенный. По полученным результатам исследования (слабая полоса антигена OspC, отсутствие других положительных полос по специфичным антигенам) нельзя дать определенное заключение о наличии IgM антител к боррелиям. При имеющихся клинических подозрениях на клещевой боррелиоз целесообразно повторить исследование через 3-4 недели.

После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул , т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блоттингом (по англ. – blotting ). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны.

Блоттинг (от англ. blotting – промокание) – это метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) одноцепочечные молекулы ДНК.

Саузерн-блоттинг (по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят следующим образом:

– Выделенную, очищенную, денатурированную и разбитую на фрагменты ДНК помещают на лист агарозного геля, где происходит электрофоретическое разделение фрагментов по массе и заряду.

– Лист агарозного геля помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором.

– Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, где происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК.

– Поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т.е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой.

– Далее ДНК денатурируют щелочью, а фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 0 С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

– ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК зондом, в котором и происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде светлых полос на рентгеновской пленке, т.е. радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра

Дот-блоттинг . Для приготовления дот-блоттов препарат ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр. Капельки препарата выглядят в виде точек на фильтре, что объясняет название типа блоттинга (англ. dot –точка). 1) Из геномной ДНК, предварительно обработанной ультразвуком, образуются фрагменты длиной 5–10 пар нуклеотидов.

2) Чтобы сделать ДНК- или РНК-пробы доступными зонду, их нужно денатурировать, т.е. перевести в одноцепочечную форму. Это происходит под воздействием температуры 100 °С.

3) Денатурированные нуклеиновые кислоты инкубируют на льду: быстрое понижение температуры предотвращает их ренатурацию, т.е. комплементарное спаривание цепей. Денатурированную ДНК или РНК наносят непосредственно на фильтр, который инкубируют в растворе, содержащем зонд.

4) Чтобы анализируемая нуклеиновая кислота не перешла в раствор, ее необходимо зафиксировать на фильтре (мембране). Для этого используют два типа фильтров: нитроцеллюлозный и нейлоновый.

Для иммобилизации нуклеиновых кислот на нитроцеллюлозном фильтре используют прожаривание при 80 °С в вакууме, а на нейлоновом фильтре – УФ-облучение в течение 3–5 минут.

5) После инкубации препарата нуклеиновых кислот с меченым изотопом зондом проводят радиоавтографию в специальной кассете или идентификацию нерадиоактивными методами.

Дот-блоттинг позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность нуклеотидов.

Нозерн-блотт анализ применяется:

1) для выделения и анализа РНК (например, для выяснения того, присутствует ли в данном типе клеток мРНК, считанные с данного гена, т.е. экспрессируется ген или нет;

2) для определения количества этой РНК и его изменения в развитии данного типа клеток;

3) для определения размера транскрипта какого-то гена.

В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда.

Если нуклеотидная последовательность искомого гена (или мРНК) не известна, но известен белок, синтез которого он контролирует, то можно выделить небольшое количество чистого белка, определить аминокислотную последовательность некоторой его части (достаточно знание 5–6 аминокислотных остатков). Пользуясь таблицей генетического кода, можно установить все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК (или самого гена), который кодирует данную аминокислотную последовательность. В этом случае можно синтезировать зонд для поиска нужных клонов в библиотеке генов.

Вестерн-блоттин г (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) –это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.

Антитела к исследуемому белку получают различными способами. Наиболее простым является введение очищенной пробы белка в кровяное русло лабораторного животного (обычно кролика). В его организме вырабатываются антитела (иммуноглобулины) к данному чужеродному белку. Это первичные антитела, которые и будут взаимодействовать с белком-мишенью.

Однако было бы не рационально вводить метку для идентификации непосредственно в данные антитела. Для определения разных белков потребовалось бы метить разные антитела, что привело бы к их высокой стоимости. Более разумным оказалось использование универсальных антител – конъюгированных антииммуноглобулинов , являющихся, по сути, антителами к антителам, выработанным при использовании идентифицируемого белка как антигена. К примеру, конъюгированные антииммуноглобулины к Ig кролика будут взаимодействовать со всеми иммуноглобулинами, синтезированными у кролика к разным антигенам. Таким образом, именно такие универсальные вторичные антитела несут изотопную или нерадиоактивную метку. Кроме неизотопной метки, которая в ходе ряда реакций приводит к образованию нерастворимого окрашенного соединения (как в случае блоттинга нуклеиновых кислот), очень часто используют хемилюминесцентную метку, обладающую более высокой чувствительностью.

1) Экстракция белков из гомогената

2) Разделение белков по молекулярным массам с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Метод SDS-электрофореза подразумевает денатурацию нативных белков. Таким образом, молекулы белка, обладающие одинаковой молекулярной массой, пройдут в геле одинаковый путь и выстроятся в виде полосы. Поскольку в смеси присутствуют белковые молекулы разного размера, образуется множество полос. Визуализировать результаты электрофореза можно окрашиванием белка (кумасси бриллиантовый синий, амидо черный, окрашивание серебром). Окрашивание серебром обладает уникальной чувствительностью, что позволяет определить всего 0,1 нг белка в полученной полосе. Это очень важно для контроля количества белка, нанесенного на гель.

3) Перенос белков из геля на мембрану. Это делается потому, что полиакриламид не позволяет диффундировать большим молекулам иммуноглобулинов к белку. А иммобилизованный на мембране белок становится доступным антителам. В отличие от блоттинга нуклеиновых кислот перенос белка на мембрану происходит под воздействием электрических сил, т.е. в электрическом поле.

4) Полученный блот инкубируют с антисывороткой к белку, а затем с антииммуноглобулинами. Результат визуализируют в соответствии с используемым типом метки.

Ограничения:

1) большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;

2) невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;

3) необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5-1 мл крови),

4) для геномной гибридизации - наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.

5) большая трудоемкость исследований