Western blot-proteinidentifikasjonsmetoder. GPM.1.7.2.0022.15 Bestemmelse av ektheten og renheten til immunbiologiske legemidler ved bruk av Western blot-metoden. Western Blot-test - når skal det gjøres

Ved utøvelse av laboratoriediagnostikk av infeksjonssykdommer er det noen ganger behov for å bestemme antistoffer ikke mot et patogen generelt, men mot visse av dets proteiner (antigener), det vil si et spekter av spesifikke antistoffer. Hvis metoden for enzymbundet immunosorbentanalyse brukes til dette formålet, er det i dette tilfellet nødvendig å først isolere og rense de nødvendige antigenene fra patogenkulturen. De resulterende proteinene påføres separat på den faste fasen. Ved bruk av en 96-brønns plate, plasseres en type antigen i hver brønn. Deretter bestemmes spesifikke antistoffer ved en indirekte metode.

Ved tilstedeværelsen av en positiv reaksjon i en brønn med et bestemt antigen, kan man bedømme tilstedeværelsen av tilsvarende spesifikke antistoffer. Disse typer immunoenzymtestsystemer tilbys av produksjonsbedrifter, men immunoblotting-metoden (Western blot) har blitt utbredt på grunn av større informasjonsinnhold og enkle gjennomføring av selve studien.

Immunblotting lar en bestemme antistoffer i blodserum samtidig og samtidig differensiert til alle diagnostisk signifikante proteiner av patogenet. Oversettelse fra engelsk Western blot betyr vestlig overføring (bokstavelig talt - blotting). Historien til dette uvanlige uttrykket er som følger.

I 1975 foreslo en vitenskapsmann ved navn E. Southern først en metode for å overføre elektroforetisk separerte DNA-fragmenter fra en gel til en membran. Ifølge forfatteren ble metoden kalt Southern blot, som oversatt betyr "sørlig overføring". Metoden for å overføre RNA-molekyler fikk på sin side kallenavnet av eksperter Northern blot - "nordlig overføring". Først som en spøk, og deretter ble dette navnet etablert i den offisielle vitenskapelige litteraturen.

I 1979 publiserte G. Towbin resultatene av de første eksperimentene på proteinblotting. I fortsettelsen av tradisjonene med "geografiske" navn for metoder for overføring av biologiske makromolekyler, begynte denne metoden å bli kalt "vestlig" overføring - Western blot.

Det første trinnet i denne metoden involverer elektroforetisk separering av en blanding av patogenproteiner i en polyakrylamidgel i nærvær av natriumdodecylsulfat (SDS). DSN, å være overfladisk virkestoff, omslutter proteinmolekyler jevnt og gir dem alle en negativ ladning på ca lik størrelse. Derfor beveger molekyler seg i et elektrisk felt i én retning, og bevegelseshastigheten avhenger bare av størrelsen på molekylet ( molekylær vekt) ekorn.

Som et resultat av den elektroforetiske prosedyren oppnås en gelplate, i hvis tykkelse proteiner er lokalisert i form av separate tynne lineære soner. I henhold til bevegelsesretningen er de delt inn i følgende rekkefølge: proteiner med stor molekylvekt, ca. 120-150 kDa, er plassert nærmere starten, og proteiner med en masse på 5-10 kDa har beveget seg lengst til mållinjen. I det andre trinnet plasseres gelplaten på et ark med nitrocellulose, og denne strukturen plasseres mellom elektrodene til kilden likestrøm. Under påvirkning elektrisk felt proteiner strømmer fra den porøse gelen til en tettere membran, hvor de er ganske fast festet.

Den resulterende blotten behandles med en blokkerende løsning som inneholder antigenisk likegyldige proteiner og/eller ikke-ioniske detergenter (Tween 20), som blokkerer antigenfrie steder på membranen. Membranarket kuttes deretter i smale strimler slik at hver strimmel inneholder alle antigene fraksjoner. De beskrevne trinnene utføres av produsenten.

Kommersielle testsystemer for å bestemme antistoffer ved bruk av immunblotting inneholder blotter (strips eller strips) som er klare for testing. Brukeren bestemmer hele spekteret av spesifikke antistoffer mot patogenproteiner ved hjelp av den indirekte metoden. Et løselig fargeløst stoff brukes som kromogen for å utføre en farge (enzymatisk) reaksjon, hvis produkt får farge, blir uløselig og legger seg (feller ut) på nitrocellulose.

Som et resultat av sekvensielle immun- og enzymreaksjoner, i nærvær av antistoffer mot patogenproteiner i testprøven, vises mørke tverrgående striper på blottet, hvis plassering er i sonen til visse patogenproteiner. Hvert slikt bånd indikerer tilstedeværelsen av spesifikke antistoffer mot det tilsvarende antigenet. Resultatet av en studie utført ved immunoblotting er gitt i form av en liste over antistoffer mot spesifikke proteiner av patogenet. For eksempel: "antistoffer mot proteinene p17 og p24 er påvist."

Nitrocelluloseblotter kan lagres tørket i lang tid etter utvikling. Intensiteten til fargen svekkes imidlertid betydelig. Våte flekker kan fotograferes eller deres grafiske bilder kan legges inn i minnet på personlige datamaskiner ved hjelp av skannere. Spesielle dataprogrammer lar deg behandle resultatene og raskt overvåke dynamikken til antistoffspekteret under dynamisk observasjon

Blotting(fra engelsk " blot" - spot) - overføring av NC-er, proteiner og lipider til en fast støtte, for eksempel en membran og deres immobilisering.

Metoder for å separere molekyler for blotting:

• elektroforese i polyakrylamidgel:
o under denaturerende forhold med tilsetning av urea - separasjon av korte enkeltkjedede NA;
o under denaturerende forhold med tilsetning av natriumdodecylsulfat (Laemmli-elektroforese) - separasjon av proteiner etter molekylvekt;
o under native forhold - separasjon av proteiner i henhold til deres tredimensjonale struktur;
• isoelektrisk fokusering - for separering av proteiner ved isoelektrisk punkt (pI);
• todimensjonal (2D) elektroforese - for separering av proteiner i to retninger - ved isoelektrisk punkt og etter molekylvekt;
• agarosegelelektroforese - NC-separasjon:
o langs lengden av lineære fragmenter;
o ved "supercoiling" av ringmolekyler;
• tynnsjiktskromatografi - separasjon av lipider fra lipidkomplekser.

Overføringsmetoder:

• diffusjon av molekyler - langsom transport, ofte brukt for lipider;
• kapillærblotting - membranen presses mot gelen, en stabel med filterpapir legges på toppen av den, overføringsbufferen fukter gelen og stiger under påvirkning av kapillærkrefter, fukter filterpapiret og overfører makromolekyler fra gelen til gelen. membran; kapillær blotting kan utføres:
o i kamre med gelen fuktet med en buffer - "halvtørr" overføring;
o i kamre med gelnedsenkning i buffer;

• vakuum blotting - ligner på kapillær blotting, men overføringen akselereres ved å bruke et vakuum i stedet for kapillærkrefter som skapes ved å fukte filterpapiret;
• elektroblotting - overføringen av ladede makromolekyler til membranen skjer under påvirkning av en elektrisk strøm;
• "sy" NC til membranen under påvirkning av UV-bestråling eller oppvarming - for endelig fiksering på nylonmembraner;
• dot blotting (slot blotting) - prøven påføres i form av en prikk eller strek direkte på membranen uten forutgående separasjon av molekylene i en gel eller på en TLC-plate.

Membrantyper:

• PVDF-membraner (polyvinylidenfluorid);
• NC-membraner (nitrocellulose);
• nylonmembraner (brukes til NDT).

Metoder for merking og påvisning av makromolekyler på en membran:

• farging - binding av et fargestoff (sølvioner, Coomassie, Ponceau, etidiumbromid) direkte til de påviste makromolekylene;
• immunkjemisk merking - merking av makromolekyler skjer på grunn av merkede antistoffer som er spesifikt bindende til dem:
o immunfarging - antistoffer er merket med fargestoffer, absorpsjonen av lys med en viss bølgelengde registreres;
o enzymimmunoassay - antistoffer er merket med et enzym, mengden farget produkt som produseres under den enzymatiske reaksjonen (ELISA) registreres;
o kjemiluminescerende - antistoffer er merket med et reporterenzym, som avgir en glød i nærvær av et substrat, og emisjonen av lys registreres
en viss bølgelengde;
o fluorescerende - antistoffer er merket med en fluorescerende etikett, som eksiteres av lys med en viss bølgelengde, emisjonen av lys registreres i
lengre bølgelengdeområde;
• strålingsmerking - strålingsmerker (radioisotoper) introduseres i makromolekyler, deteksjon utføres ved å bruke:
o autoradiografi (ved å påføre fotografisk film på membranen);
o radioavbildning (kvantitativ bestemmelse av strålingsutslipp og konstruksjon av et bilde relativ posisjon koder);
• hybridisering - binding nukleinsyrer merkede oligonukleotider med en komplementær struktur, deteksjon utføres som regel ved å registrere emisjonen av stråling eller fluorescens av markøren;
• massespektrometri - brukes til direkte struktur analyse lipider.

Godkjente navn for blotting-typer:

• Southern blotting(Southern blotting) - oppkalt etter Edwin Southern, som foreslo metoden - bestemme DNA-sekvensen i en prøve og bestemme antall genkopier i genomisk DNA. Overføring til membranen innledes med fordøyelse av prøven ved restriksjonsendonukleaser til fragmenter og deres fraksjonering ved elektroforese i en agarosegel. Membrananalysen utføres ved hybridisering med merkede oligonukleotider med kjent sekvens;
• Northern blotting- bestemmelse av RNA-sekvensen i prøven og studie av genuttrykk (mRNA-bestemmelse). Ligner på Southern blotting, men RNA-molekyler isolert fra prøven undersøkes, uten endonukleasefordøyelse. Molekylær separasjon utføres i en agarosegel med tilsetning av formaldehyd (for å denaturere RNA) eller i en polyakrylamidgel med tilsetning av urea (brukes til mikroRNA-analyse). Immobilisering av RNA-molekyler på membranen skjer på grunn av oppvarming under vakuum eller "kryssbinding" ved bruk av UV-bestråling;
• Western blotting– Proteinimmunoblotting er en analysemetode som brukes for å identifisere spesifikke proteiner i en prøve. Overføring til membranen innledes med separering av proteiner i en polyakrylamidgel. Analysen av proteiner på membranen utføres immunkjemisk;
• far western blotting- proteinblotting, brukt til å bestemme protein-protein-interaksjoner, lik Western blotting, men i stedet for antistoffer, brukes andre proteiner som spesifikt binder seg til proteinet som studeres;
• Southern blotting- bestemmelse av proteiner som binder seg til DNA og steder i DNA-molekyler som proteiner binder til - lignende Western blotting, men etter denaturerende elektroforese i en polyakrylamidgel vaskes proteinene fra natriumdodecylsulfat i nærvær av urea og overføres til en nitrocellulosemembran ved diffusjon. Som en prøve brukes merkede DNA-fragmenter av forskjellig lengde, oppnådd ved å splitte et større fragment av genomisk DNA som studeres. Bunne DNA-molekyler blir deretter vasket ut fra hvert protein-DNA-kompleks og analysert ved polyakrylamidgelelektroforese;
• Østlig blotting- bestemmelse av post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner (assosierte lipider, glykopolysakkarider, fosfatrester) - ligner på Western blotting, men antistoffer brukes ikke mot proteiner, men mot lipider, glykopolysakkarider, etc. I tillegg til antistoffer brukes også andre proteinmolekyler som binder seg til testpersonene (for eksempel lektin) som prøver;
• fjernøstlig blotting- analyse av lipider separert ved høyytelses tynnsjiktskromatografi. Overføring til membranen utføres vanligvis ved diffusjon. Registrering utføres ved direkte massespektrometrisk strukturanalyse.

Last ned manualen

Essensen av metoden. Western blotting (immunoblotting, fra engelsk. Blotting- blotting) er en moderne, svært sensitiv analysemetode som brukes til å bestemme spesifikke proteiner i en prøve ved bruk av antistoffer.

Metoden er basert på en kombinasjon av gelelektroforese og den immunkjemiske "antigen/antistoff (testprotein)"-reaksjonen. Høy grad oppløsning oppnås gjennom elektroforetisk separasjon av proteiner og spesifisiteten til mono- eller polyklonale antistoffer. Under optimale forhold kan Western blotting oppdage protein i mengder på mindre enn 1 ng.

Western blotting-trinn:

1. Separasjon av proteiner ved SDS-elektroforese. Den vanligste metoden for å separere proteiner er polyakrylamidgelelektroforese i nærvær av natriumdodecylsulfat. SDS). I nærvær av SDS får proteinene som skal analyseres den samme negative ladningen, noe som gjør det mulig å separere dem kun avhengig av molekylvekt. Denaturerte proteiner migrerer i det elektriske feltet gjennom akrylamidgelen til anoden, med mindre proteiner som beveger seg raskere. Markører (en blanding av proteiner med kjente molekylvekter) påføres også gelen. Forskjeller i fremskrittshastigheten (elektroforetisk mobilitet) fører til separasjon av proteiner i bånd.
2. Overføring av proteiner fra gel til membran(laget av nitrocellulose eller polyvinylidenfluorid). PVDF) oppstår under påvirkning av elektrisk strøm. Som et resultat av denne prosessen havner proteiner i et tynt overflatelag av membranen, hvor de binder seg til membranen på grunn av hydrofobe og elektrostatiske interaksjoner. Proteiner beveger seg fra gelen til membranen mens de beholder sin plassering. Etter elektrooverføring får vi altså en kopi av en gel på nitrocellulose med proteiner plassert på samme måte som i en polyakrylamidgel.
3. Blokkering. For å forhindre uspesifikk binding av antistoffer til membranen, inkuberes sistnevnte i en fortynnet proteinløsning - vanligvis brukes bovint serumalbumin eller skummetmelkpulver. Protein fra en fortynnet løsning binder seg til membranen på steder hvor det ikke er proteinbånd. Som et resultat kan antistoffer, når de tilsettes, bare binde seg til spesifikke bindingssteder for proteinene som studeres. Blokkering lar deg oppnå en ren bakgrunn og eliminere falske positive resultater.
4. Binding av proteinet som studeres til antistoffer. Etter blokkering av membranen, vaskes den med buffer (3 ganger) og inkuberes sekvensielt med forskjellige antistoffer ved bruk av "sandwich"-metoden: først binder proteiner seg til primære (mono- eller polyklonale) antistoffer, som igjen binder seg til sekundære antistoffer konjugert med enzymer (peroksidase pepperrot eller alkalisk fosfatase).
5. Gjenkjenning. Visualisering av proteinet som studeres oppnås ved å utføre passende biokjemisk reaksjon med dannelse av et produkt, som bestemmes av kolorimetriske, kjemiluminescerende eller fluorescerende deteksjonsmetoder. Mengden protein vurderes ved hjelp av densitometri.

Planlagt visualisere og kvantifisere fotosystem 2 lys høstende komplekse protein Lhcb2 fra thylakoider Arabidopsis thaliana.
Alle spørsmål og forslag send til adressen.

Og i andre naturvitenskapelige disipliner.

Andre lignende metoder bruker antistoffer for å oppdage proteiner i vev og celler gjennom immunfarging og enzymkoblet immunsorbentanalyse (ELISA). ELISA).

Western blotting ble utviklet i laboratoriet til George Stark. George Stark) på Stanford. Navnet Western blot ble gitt til teknikken av W. Neil Burnett. W. Neal Burnette) og er et ordspill på navnet Southern blotting, en DNA-bestemmelsesteknikk tidligere utviklet av Edwin Southern. En lignende metode for å bestemme RNA kalles Northern blotting påvisning av post-translasjonelle modifikasjoner av proteiner kalles Eastern blotting. Østlig blotting).

Prøveforberedelse

Prøven kan tas fra helvev eller fra en cellekultur. I de fleste tilfeller blir fast vev først knust mekanisk ved hjelp av en blender (for store prøvevolumer), en homogenisator (mindre volumer) eller sonikering. På samme tid, bakterier, virus og andre komponenter miljø er også en kilde til proteiner.

Gelelektroforese

Proteiner separeres ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese. Proteinseparasjon kan gjøres ved isoelektrisk punkt (pI), molekylvekt, elektrisk ladning eller en kombinasjon av disse parameterne.

Den vanligste metoden for å separere proteiner er polyakrylamidgelelektroforese i nærvær av natriumdodecylsulfat. SDS) ifølge Laemmli. SDS forårsaker denaturering av proteiner og opprettholder dem i en denaturert tilstand, for eksempel ditiotreitol og merkaptoetanol, brukes til å ødelegge de sekundære og tertiære strukturene til proteiner. Denaturerte polypeptider migrerer i det elektriske feltet gjennom akrylamidgelen til anoden, med mindre proteiner som beveger seg raskere og dermed separeres i henhold til molekylvekt. Konsentrasjonen av akrylamid bestemmer oppløsningen av gelen - jo høyere konsentrasjon av akrylamid, jo bedre oppløsning av lavmolekylære proteiner. Lav akrylamidkonsentrasjon forbedrer oppløsningen for proteiner med høy molekylvekt. Det er også mulig å bruke todimensjonal elektroforese (2-D). I dette tilfellet utføres separasjonen av proteiner i to retninger - i samsvar med deres isoelektriske punkt i den første retningen, og i samsvar med deres molekylvekt i den andre.

Prøver påføres gelen i lommene. Som regel er ett av "sporene" igjen for molekylmassemarkører (blandinger av proteiner med kjente masser). Etter at spenning er påført, beveger proteiner seg i et elektrisk felt med i forskjellige hastigheter. Forskjeller i fremskrittshastighet - elektroforetisk mobilitet - fører til separasjon av proteiner i bånd. band).

Overfør til membran

For å gjøre proteiner tilgjengelige for antistoffer og videre påvisning, overføres de sammen med en gelstrimmel til en membran laget av nitrocellulose eller polyvinylidenfluorid. PVDF). Membranen legges på toppen av gelen, og en stabel med filterpapir legges oppå den. Hele stabelen er plassert i en overføringsbuffer, som beveger seg oppover i papiret under påvirkning av kapillærkrefter, og bærer proteinene med seg. En annen metode for proteinoverføring kalles elektroblotting og bruker elektrisitet, som overfører proteiner fra gelen til membranen. Proteiner beveger seg fra gelen til membranen mens de beholder sin plassering. Som et resultat av denne "blotting" (fra engelsk. blotting) prosess beholdes proteiner på et tynt overflatelag av membranen for påvisning. Begge membranalternativene brukes på grunn av deres evne til å binde proteiner uspesifikk. Proteinbinding er basert på både hydrofobe interaksjoner og elektrostatiske interaksjoner mellom membranen og proteinet. Nitrocellulosemembran er billigere enn PVDF, men er mye mer skjør og tåler ikke gjentatt merking.

Ensartetheten og den totale effektiviteten av proteinoverføring fra gelen til membranen kan testes ved å farge membranen med Coomassie blue eller Ponceau S. Coomassie er den vanligste av de to, mens Ponceau S er mer følsom og mer løselig i vann, noe som gjør påfølgende vask og merking av membranen lettere.

Blokkering

Når en membran er valgt for dens evne til å binde proteiner, antistoffer og målproteinet er valgt, må man passe på å unngå interaksjon mellom membranen og antistoffet som brukes til å påvise målproteinet (siden antistoffet i seg selv er et protein) . Blokkering av uspesifikk binding oppnås ved å plassere membranen i en fortynnet proteinløsning - vanligvis bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri tørrmelkpulver (begge billig), med en liten prosentandel vaskemiddel som Tween 20. Proteinet fra den fortynnede løsningen fester seg til membranen på alle steder hvor målproteinet ikke har festet protein. Derfor, når antistoffer tilsettes, er det ingen ledig plass på membranen for dem å feste seg til, annet enn bindingssteder på spesifikke målproteiner. Denne bakgrunnsstøyen i det endelige Western blot-produktet resulterer i rene resultater og utelukkelse av falske positiver.

Gjenkjenning

Under deteksjonsprosessen blir membranen "merket" med proteinet av interesse med et modifisert antistoff som er koblet til et reporterenzym som er utsatt for passende støtte, noe som resulterer i en kolorimetrisk reaksjon og produserer farge. Av ulike årsaker utføres deteksjon i to trinn, selv om en ett-trinns deteksjonsmetode nå er tilgjengelig for visse applikasjoner.

Antistoffer produseres ved å eksponere en vertsklasse eller kultur av immunceller for et eller annet protein (eller deler av det) Vanligvis er dette en del av immunresponsen, men her (i analysen) brukes de innsamlede antistoffene som et spesifikt og sensitivt. deteksjonsverktøy som binder seg direkte til proteinet.

Etter blokkering inkuberes en fortynnet primær antistoffløsning (vanligvis mellom 0,5 og 5 μg/ml) med membranen og ristes forsiktig. Vanligvis består løsningen av en bufret saltløsning med en liten prosentandel vaskemiddel, noen ganger med melkepulver eller BSA. Antistoffløsningen og membranen kan forsegles sammen og inkuberes alt fra 30 minutter til over natten. De kan også inkuberes ved forskjellige temperaturer ved forhøyede temperaturer, bedre binding observeres - både spesifikk (målprotein, "signal1") og uspesifikk ("støy").

Etter å ha skylt membranen for å fjerne ubundne primære antistoffer, eksponeres membranen for andre antistoffer som direkte binder seg til klassespesifikke områder av de primære antistoffene. Disse er kjent som sekundære antistoffer, og i henhold til deres målegenskaper kalles de vanligvis "anti-mus", "anti-geit" og så videre. Antistoffer oppnås fra en animalsk kilde (eller animalske kilder fra hybridomkulturen); sekundære anti-mus-antistoffer vil binde seg til de fleste mus-avledede primære antistoffer. Dette skaper noen besparelser ved å la et individuelt laboratorium bruke en enkelt kilde for bulkantistoffproduksjon, og fører til mye mer reproduserbare resultater. Sekundære antistoffer er vanligvis koblet til biotin eller til et reporterenzym som alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase. Dette betyr at flere sekundære antistoffer kan binde seg til en primær og forsterke signalet.

De vanligste pepperrotperoksidase-relaterte sekundære antistoffene brukes til å kutte det kjemiluminescerende middelet, og reaksjonsproduktet produserer selvlysende utslipp proporsjonalt med mengden protein. Et ark med lysfølsom fotografisk film plasseres mot membranen og utsettes for reaksjonsstråling, og skaper et bilde av antistoffbånd på blottet. En billigere, men mindre følsom tilnærming ved bruk av 4-kloronaftol-beis blandet med 1 % hydrogenperoksid; reaksjonen av peroksydradikalet med 4-kloronaftol gir en mørkebrun farge, som registreres uten bruk av spesiell fotografisk film.

En tredje alternativ metode bruker en radiomerking i stedet for et enzym bundet til et sekundært antistoff, for eksempel et merket antistoffbindende protein type Protein A Staphylococcus med en radioaktiv isotop av jod. Andre metoder er sikrere, raskere og billigere, så radioaktiv deteksjon brukes sjelden.

Historisk sett har merkeprosessen blitt utført i to trinn fordi det er relativt lettere å produsere primære og sekundære antistoffer i separate prosesser. Dette gir forskere og bedrifter enorme fordeler når det gjelder fleksibilitet, og legger til et forsterkningstrinn til deteksjonsprosessen. Gitt bruken av proteinanalyse med høy gjennomstrømning og lave deteksjonsterskler, er det fortsatt interesse for å utvikle et ett-trinns merkingssystem som lar prosessen gå raskere og til en lavere kostnad. Det (ett-trinnssystemet) krever antistoffmerker som gjenkjenner proteinet av interesse og som samtidig bærer en markør for deteksjon - tagger som er mest tilgjengelige for kjente proteinhaler. Taggene inkuberes først på membranen i en to-trinns metodestil med primære antistoffer, og er deretter klare for direkte påvisning etter en serie med vask.

Analyse

Etter å ha vasket av ubundne etiketter, er Western blot klar til å oppdage prober bundet til målproteinet. I praksis oppdager ikke alle vestlige proteiner av bare ett bånd på membranen. Den omtrentlige størrelsen beregnes ved å sammenligne de fargede båndene med molekylvektsmarkører tilsatt under elektroforese. Prosessen vil gjentas med strukturelle proteiner som aktin eller tubulin, som ikke endres mellom forsøkene. Mengden målprotein avhenger av mengden strukturelt kontrollprotein mellom grupper. Denne teknikken sikrer at mengden av totalt protein på membranen blir korrigert i tilfelle feil eller ufullstendig overføring.

Kolorimetrisk deteksjon

Den kolorimetriske deteksjonsmetoden er basert på å inkubere en Western blot med et substrat som reagerer med et reporterenzym (som pepperrotperoksidase). pepperrotperoksidase), "sitter" på det sekundære antistoffet. Det løselige fargestoffet endres til en uoppløselig form med en annen farge, avsettes ved siden av enzymet og farger membranen. Veksten av flekken begrenses ved å vaske av det løselige fargestoffet. Proteinnivået vurderes densitometrisk ved fargeintensitet eller spektrofotometrisk.

Kjemiluminescensdeteksjon

Ker basert på inkubering av en nitrocellulosemembran med et substrat som lyser opp etter interaksjon med en sekundær antistoffreporter. Lyset tas opp med fotografisk film eller et CCD-kamera, som digitalt fanger Western blot. Bildet analyseres densitometrisk, vurderer den relative mengden farget protein og gir et kvantitativt resultat i optiske tetthetsenheter. Ny programvare lar deg gjennomføre videre analyse data, for eksempel for å bestemme molekylvekt hvis en passende standard ble brukt.

Radioaktiv deteksjon

Radioaktive sporstoffer krever ikke enzymsubstrater, men lar medisinsk radiografisk film plasseres foran en Western blot, slik at den kan samhandle med etikettene og skape mørke områder som tilsvarer båndene til proteinet som studeres (i bildet på Ikke sant). Etterspørselen etter radioaktive deteksjonsmetoder synker på grunn av deres høye kostnader, høye helse- og sikkerhetsrisikoer og alternativene som tilbys av ECL.

Fluorescensdeteksjon

Fluorescerende tagger begeistres av lys og sender ut lys med lengre bølgelengde, som oppdages av fotosensorer som et CCD-kamera utstyrt med passende emisjonsfiltre. Kameraet tar et digitalt bilde av Western blot, som tillater videre analyse av de resulterende dataene, for eksempel molekylvektsanalyse og kvantitativ Western blot-analyse.

Er vanlig.

Alle vestlige iscenesettelser består av følgende trinn:

1) overføring av protein fra gelen til membranen;
2) blokkering av uspesifikk sorpsjon;
3) adsorpsjon av I-antistoffer;
4) vasking;
5) adsorpsjon av II-antistoffer;
6) vasking;
7) filterutvikling;

Hvilken type membran du skal bruke: NC eller PVDV (de sier sistnevnte er mer følsom) avhenger bare av din smak. NC-membranen er mer skjør, men med forsiktig betjening merkes ikke dette.

Poengene.

Hvorvidt du skal trimme gelen, og bare la det området du vil se på bildet før overføring, etter overføring, eller ikke trimme i det hele tatt, avhenger av ønsket om å spare membran og antistoffer.

Kan gjøres i gelbad.

Men det er bedre å bruke alt på en gang uten bobler.

Eller ~3mA per individuell stripe.

Noen ganger er det nyttig å markere plasseringen av gelgrenser, brønner osv.

Du kan kontrollere hvor mye protein som er igjen i gelen etter overføring ved å farge gelen.

Hybridisering.

Filteret skal alltid være vått.

Den tørkede PVDF-membranen må fuktes med metanol.

Side P (som overføringen skjedde til) skal være i kontakt med løsningen.

Hybridisering med a/t utføres i en hybridisator ved 26 o C i små sylindre eller 50 ml CF-rør. Volumet av hybridiseringsløsningen er ~3ml (så minimalt som mulig, men slik at membranen ikke tørker ut).

Vasking og fylling: med NT, risting i badekar (lokk fra typer) V = 30-50ml.

Enten kast løsningen eller utfør hybridisering i den, bare ikke slipp konsentrert a/t på filteret.

For å fylle uspesifikke materialer er det best å bruke melkepulver (BSA er også mulig, men vi liker det mindre). Ulike partier varierer litt i bakgrunnsintensitet.

Hell hybridiseringsløsningen i et 50 ml CF-rør, tilsett den nødvendige mengden a/t, bland. Legg filteret langs veggen av reagensrøret og plasser det i hybridisatoren.

Hvis du ikke vet ved hvilken fortynning a/t-ene virker, må du bestemme dette eksperimentelt.

Interaksjonstiden med antistoffer kan økes eller reduseres avhengig av antistoffene dine.

Hybridisering utføres i 0,1-0,15M NaCl; en reduksjon i ionestyrke forårsaker sterk uspesifikk hybridisering.

Veldig viktig!!! Løsningen med antistoffer kan brukes flere ganger (5-7). Det er nok å fryse den etter bruk ved -20 o C. Denne prosedyren fungerer i det minste for hybridiseringsbufferen: 1x PBS (uten Mg++/Ca++), 0,3-1,0 % Tørrmelk, Antistoffer.

Ved immunfarging etter immunutfelling kan bakgrunnen fjernes ved å forhåndskonjugere de sekundære antistoffene til de primære.

Den gitte prosedyren er ikke den eneste. Alternativer:

1. Gjør alt med NT på en svingende plattform, hybridisering og pakking i plastposer (V-løsning ~1,5ml, avhengig av filterstørrelsen), vask i badekar:
1. fyll: 3% melkepulver, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1 time 0,3% melkepulver, 1x PBS, antiserum;
3. vask 3 ganger x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" i 1 x PBS;
5. vask som i trinn 3.

Til tross for det betydelig lavere innholdet av tørrmelk i hybridiseringsbufferen for "I" a/t og fullstendig fravær i bufferen for "II" a/t, ga denne metoden klare bilder. Tilsynelatende ble suksessen bestemt av kvaliteten på kjøretøyene som ble brukt.

2. Vasking og fylling utføres i et bad. Hybridisering: legg et stykke parafilm (større enn en membran) på bordet, og 0,5-1 ml hybridiseringsløsning med a/t på. Plasser membranen med siden (P) vendt mot løsningen, unngå bobler, og dekk toppen med et stykke parafilm på størrelse med membranen. Inkuber 1 time.

Denne metoden reduserer volumet av hybridiseringsblandingen, men kan forringe kvaliteten på hybridiseringen.

Maksimal glød oppstår 4-5" etter påføring av løsningen (rimelig glødeintensitet opprettholdes i 15-20").